疫苗DNA殘留對(duì)人體的潛在危害

對(duì)所使用的疫苗，我們zui關(guān)心的是疫苗的效果和其安全性?，F(xiàn)在很多疫苗是細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，比如重組（CHO細(xì)胞）乙肝疫苗，Vero細(xì)胞狂犬病疫苗等大多數(shù)疫苗都是用細(xì)胞培養(yǎng)的方法生產(chǎn)，而對(duì)疫苗的純化是關(guān)鍵問(wèn)題，我們要盡可能的去除宿主細(xì)胞DNA和宿主蛋白。假若宿主細(xì)胞的DNA和蛋白同疫苗一起注入人體將會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)料的后果。就以疫苗DNA殘留為例，疫苗DNA殘留可能造成插入突變﹑導(dǎo)致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui終造成疫苗使用者致癌。

疫苗DNA殘留的相關(guān)法規(guī)

由于有如此潛在的危險(xiǎn)性，所以許多機(jī)構(gòu)對(duì)疫苗DNA殘留制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，1986年世界衛(wèi)生組織規(guī)定用細(xì)胞系生產(chǎn)的疫苗DNA殘留不能超過(guò)100 pg /支 ，而在1998年世界衛(wèi)生組織認(rèn)為細(xì)胞系生產(chǎn)的疫苗DNA殘留不能超過(guò)10 ng /支，而在1997年美國(guó)藥品食品衛(wèi)生監(jiān)督局規(guī)定在美國(guó)使用的細(xì)胞系疫苗DNA殘留不能超過(guò)10 pg /支，中國(guó)規(guī)定的細(xì)胞系疫苗DNA殘留不能超過(guò)100 pg /支。

所以在疫苗生產(chǎn)中要隨時(shí)對(duì)DNA殘留進(jìn)行檢測(cè)，以便知道每個(gè)過(guò)程除掉DNA殘留的能力。在每一批產(chǎn)品中我們必須檢測(cè)DNA殘留，所以我們必須運(yùn)用敏感且行之有效的對(duì)DNA殘留定量的檢測(cè)方法。通常規(guī)定每支疫苗DNA殘留不能超過(guò)100 pg，也就大約等同于17個(gè)甚至更少CHO細(xì)胞基因組DNA的含量，對(duì)如此微量的DNA殘留進(jìn)行檢測(cè)，所用的技術(shù)方法就必須相當(dāng)敏感和穩(wěn)定，現(xiàn)在對(duì)DNA殘留定量的方法主要有以下三種：
1、分子雜交技術(shù)檢測(cè)DNA殘留
2、基于DNA結(jié)合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）檢測(cè)DNA殘留
3、實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)DNA殘留

分子雜交技術(shù)檢測(cè)DNA殘留的原理和方法

分子雜交分析的基本原理是基于DNA探針檢測(cè)變性而且固定在硝-酸纖維素膜上的宿主細(xì)胞DNA。這些探針可以不依賴宿主細(xì)胞DNA來(lái)制備，例如用隨機(jī)引物制備探針。探針上標(biāo)記酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛標(biāo)記核酸探針，操作方便、靈敏度高，已標(biāo)記的探針在4℃貯存可達(dá)兩年之久，方便隨時(shí)應(yīng)用，所以現(xiàn)在常采用地高辛標(biāo)記核酸探針，用光標(biāo)記法將光敏Dig標(biāo)記到探針上，制成光敏-Dig-核酸探針，再與固定在硝--酸膜上的靶核酸進(jìn)行靶DNA分子雜交，使之與抗Dig-堿性磷酸酶結(jié)合，zui后可用不同的檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)光檢測(cè)和顯色檢測(cè)均可，靈敏度可達(dá)10pg以下（表 1  三種DNA殘留檢測(cè)方法的比較）。

基于DNA結(jié)合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）檢測(cè)DNA殘留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析系統(tǒng)是基于兩種DNA序列非特異性蛋白，單鏈DNA（ssDNA）結(jié)合蛋白（SSB）和抗ssDNA 的單抗。檢測(cè)的基本過(guò)程是當(dāng)生物素—DNA單鏈結(jié)合蛋白和尿素酶—抗ssDNA 的單抗與變性的宿主細(xì)胞DNA結(jié)合zui終形成復(fù)合物，通過(guò)親合素將此復(fù)合物連接到生物素—硝--酸纖維素膜，在通過(guò)洗滌所有非特異性的被洗脫掉，zui后放于有尿素溶液的讀數(shù)儀，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 導(dǎo)致PH值發(fā)生變化，讀數(shù)儀根據(jù)PH值的變化換算成DNA的量，從而達(dá)到檢測(cè)DNA殘留含量的目的。

實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)DNA殘留的原理和方法

熒光定量PCR是基于PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，產(chǎn)物的增加可以通過(guò)熒光信號(hào)指示，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣本中初始模板進(jìn)行定量分析。定量PCR可實(shí)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)物量，通過(guò)加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線中的位置推算初始模板的濃度，從而達(dá)到檢測(cè)DNA殘留含量的目的。

三種檢測(cè)DNA殘留方法的比較

3種方法用來(lái)檢測(cè)疫苗DNA殘留都要對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)的處理，這對(duì)zui終的結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。而雜交相對(duì)對(duì)樣品DNA的損失小，而用Q-PCR需要提取樣品的DNA，損失較大。在我們選擇那種方法時(shí)我們要考慮它的穩(wěn)定性，敏感性，成本等以至找到*的性價(jià)比的方法（表 1），從表1 我們不難發(fā)現(xiàn)使用分子雜交的方法是一種比較可行經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法，目前國(guó)內(nèi)也主要是用此方法。

表 1  三種DNA殘留檢測(cè)方法的比較

羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒產(chǎn)品簡(jiǎn)介

產(chǎn)品中文名稱：高效DNA地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒II

羅氏應(yīng)用科學(xué)部（Roche Applied Science）是zui早致力于向用戶提供非放射標(biāo)記技術(shù)的公司之一，讓更多的科研工作者們可以避免使用危險(xiǎn)的放射性同位素。DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II（第二代）是由羅氏公司研發(fā)，并且是在DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I（*代）的基礎(chǔ)上優(yōu)化升級(jí)的，具有更高的準(zhǔn)確性、更好的靈敏度、操作時(shí)間更短等特點(diǎn)。自1995年地高辛產(chǎn)品上市以來(lái)，盡管有定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，DIG系統(tǒng)仍然是非放射性高效標(biāo)記—檢測(cè)技術(shù)的*，被廣泛地應(yīng)用各種膜雜交及原位雜交技術(shù)中。

高效DNA地高辛標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒II 圖片

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羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II檢測(cè)原理

該產(chǎn)品是用地高辛（地高辛：英文名Digoxigenin，簡(jiǎn)稱DIG；又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子）標(biāo)記的DNA探針，應(yīng)用于分子雜交和隨后的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。檢測(cè)主要分三階段進(jìn)行：1. DNA標(biāo)記：根據(jù)隨機(jī)引物標(biāo)記技術(shù)，生成DIG地高辛標(biāo)記的DNA探針。 2. 雜交：按照標(biāo)準(zhǔn)雜交方法進(jìn)行，將地高辛標(biāo)記的DNA探針用于核酸點(diǎn)雜交，可選擇帶正電的尼龍膜或純硝--酸纖維素膜作為雜交膜。 3. 免疫學(xué)檢測(cè)：首先將標(biāo)記有AP的地高辛抗體與雜交探針免疫結(jié)合；然后在477 nm波長(zhǎng)下，通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶與CSPD底物產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的數(shù)值，從而達(dá)到免疫檢測(cè)的目的。

羅氏Roche DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II的顯著特點(diǎn)

★ Accurate and fast-----使用預(yù)混合的高效地高辛（DIG）標(biāo)記的隨機(jī)引物可以縮短標(biāo)記DNA探針的操作時(shí)間，提高標(biāo)記物的產(chǎn)量。
★ Sensitive-----在人類DNA的復(fù)合物和植物基因組中，可以檢測(cè)到單個(gè)拷貝的基因。
★ Time-saving-----地高辛（DIG）標(biāo)記的探針可以儲(chǔ)存一年以上，雜交液可以反復(fù)使用3～5次（具體要根據(jù)每次雜交過(guò)程中標(biāo)記探針產(chǎn)生信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)確定）。

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生物制品加工過(guò)程中培養(yǎng)物殘留的污染物（Bioprocess Contaminant, BC）ELISA檢測(cè)試劑盒

宿主細(xì)胞蛋白（Host Cell Protein, HCP）殘留檢測(cè)ELISA試劑盒

例如： Vero Cell HCP ELISA Kit
           CHO HCP ELISA Kit, 3G
           Pichia pastoris HCP ELISA Kit 
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