上海起發(fā)GMP級(jí)別轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)

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儲(chǔ)存溫度：2-4℃保存?年。（避免冷凍）

產(chǎn)品描述

BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級(jí)別轉(zhuǎn)染試劑，本制品利BIOHUB公司生產(chǎn)的線性陽(yáng)離子聚合物,按照符合GMP認(rèn)證管理體系下，采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，所用起始材料及所需化學(xué)品和配制過(guò)程均在無(wú)菌環(huán)境中操作進(jìn)行，以確保制造過(guò)程中每個(gè)步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴(yán)格控制重金屬殘留、細(xì)菌內(nèi)毒素殘留等，生產(chǎn)工藝符合 GMP 規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程，保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。

1.PH值檢測(cè)通過(guò)中國(guó)藥典 2020版第四部 pH 值測(cè)定法(通則 0631)

2.檢測(cè)遵循《人用基因治療總論-中國(guó)藥典 2020》國(guó)家藥典委。

3.檢測(cè)遵循USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered 4.Products 用于細(xì)胞治療，基因治療和組織工程產(chǎn)品中的輔料。

5.細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)符合中國(guó)藥典2015版四部通則（1143）方法2光度測(cè)試法（動(dòng)態(tài)濁度法）

6.重金屬殘留檢測(cè)符合國(guó)藥典 2020版第四部重金屬檢查法(通則 0821)

7.支原體檢測(cè) 使用支原體檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品特點(diǎn)

    BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩(wěn)定的高表 達(dá)（96 孔板至 100L 生物反應(yīng)器）。現(xiàn)在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染.。

1.GMP級(jí)別定制監(jiān)管，支持并滿足合規(guī)要求。

2.不含動(dòng)物源性成分。

3.嚴(yán)格遵循以下規(guī)范生產(chǎn) 1. ISO 9001:2015, certified facility。

4.嚴(yán)格按照《GMP 附錄-細(xì)胞治療產(chǎn)品》國(guó)家藥品監(jiān)督管理局。

5.從工藝開(kāi)發(fā)到臨床試驗(yàn)和商業(yè)化的無(wú)縫過(guò)渡生產(chǎn)細(xì)胞系（HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產(chǎn)量。

6.超高的性價(jià)比

操作方法參考

一、貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以 6 孔板轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞為例：

（一）轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備

1) 轉(zhuǎn)染前一天：用膠原酶 （WORTHINGTONG 公司 LS004196)消 化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用胰酶）。 按照每孔2×10 6的細(xì)胞量接種293T至6孔板(每孔加入2ml新鮮DMEM:F12+5%FBS *培養(yǎng)基和 1ml 的細(xì)胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養(yǎng)箱培24h。

2) 24h 后,移除之前培養(yǎng)基，每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。

注意：確保 293T 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好傳代 不超過(guò)15代。

（二）轉(zhuǎn)染過(guò)程

3) 第一天：顯微鏡下檢查細(xì)胞匯合度，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70%到 80%的匯合度時(shí)，開(kāi)始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。

4) 對(duì)于每孔細(xì)胞，用 100µl 無(wú)血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。

5) 對(duì)于每孔細(xì)胞，用100μ無(wú)血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋適當(dāng)比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP  的比例要依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)摸索最適比例。

6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO  GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中（總體積 200µL）輕輕混勻， 室溫孵育30分鐘。

7) 小心地將 BIOHUB-PRO  GMP復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。注 意加入混合液時(shí)輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細(xì)胞的頂部以免破壞細(xì)胞的粘附性。

8) 將培養(yǎng)板放入 37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。

（三）觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果 9) 第二天：在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，通常超過(guò) 80%的 293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的 24h 可以觀察到綠色熒光。 小貼士 :建議進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)對(duì) BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最適比例， 通常篩選范圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過(guò)進(jìn)口品牌的 PEI，用BIOHUB-PRO  GMP時(shí)應(yīng)適當(dāng) 降低使用濃度。

通常情況下，分別準(zhǔn)備BIOHUB-PRO GMP 和DNA轉(zhuǎn)染溶液時(shí)其體積一般是轉(zhuǎn)染前每孔細(xì)胞培 養(yǎng)液體積總量的 1/10-1/20，如細(xì)胞培養(yǎng)液體積為 3ml，則稀釋BIOHUB-PRO  GMPI及 DNA 的體積為150ul。質(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml（DNA 質(zhì)量/細(xì)胞培養(yǎng)總體積）[1][4]。 不同質(zhì)粒種類以及大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，如較大片段插入質(zhì)粒可能轉(zhuǎn)染效率低，可根據(jù) 實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整，如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭康取??HEK293 GnTI 細(xì)胞重懸浮可用槍頭或移液管反復(fù)吹打，但 CHO-S 細(xì)胞的粘附性比較強(qiáng) 重懸浮時(shí)需要借助細(xì)胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細(xì)胞，如果表達(dá)的是膜蛋白，胰酶消化細(xì)胞可能會(huì)降低蛋白表達(dá)， 建議用膠原酶消化細(xì)胞，我們推薦(LS004196WORTHINGTONG)的膠原酶。 對(duì)于貼壁性低的細(xì)胞系，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。 一旦確定了細(xì)胞類型、培養(yǎng)基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例，就可以在轉(zhuǎn)染后 24 至 96 小時(shí)內(nèi)多次觀察轉(zhuǎn)染效率，以優(yōu)化最大表達(dá)量時(shí)間點(diǎn)。

二、懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染 離心對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)基重懸浮使細(xì)胞密度達(dá)到 1×10 6cells/mL 小規(guī)模轉(zhuǎn) 染時(shí)，如需大規(guī)模轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度要到達(dá) 2-3×10 6cellsml/mL，可參考文獻(xiàn)[4]。以 293F 細(xì)胞 于 100mL 培養(yǎng)瓶（溶液體積占瓶體積的 1/5）操作體系舉例如下：

（一）轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備

 1) HEK293F 細(xì)胞傳代接種于 20mL 懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(36.5℃，120rpm，5%CO2 )的條 件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度到 1X10 6cells/mL，然后旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)，2~4 小時(shí) 后可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

（二）轉(zhuǎn)染過(guò)程

 2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋適量的 DNA，使 DNA 終濃度為 1ug/ml（DNA/總 培養(yǎng)體積）?；靹虿㈧o置 5min。

 3) 用1mlOptiPRO™SFM(無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的BIOHUB-PRO GMP，混勻并靜置 10min。

（78BioPEI：DNA 參考比例范圍，可參考上述貼壁細(xì)胞BIOHUB-PRO GMP和 DNA 優(yōu)化方案優(yōu)化）。

 4) 將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中輕輕混勻，室溫孵育 30 分鐘。

 5) 將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，搖勻后旋緊瓶口放回?fù)u床 （36.5℃，5%CO2,120rpm）。

 6) 基因表達(dá)可在 24-72 小時(shí)后檢測(cè)，具體時(shí)間取決于細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因.

小貼士

在懸浮培養(yǎng)中，單個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要高于聚集在一起的細(xì)胞，需要優(yōu)化適合單細(xì)胞的 生長(zhǎng)條件。 方形瓶應(yīng)經(jīng)過(guò)兩個(gè)連續(xù)的干燥循環(huán)高壓滅菌（每個(gè) 45 分鐘，干燥 15 分鐘） 蓋子應(yīng)盡可能松，不得脫落。應(yīng)該讓它們冷卻擰緊蓋子前，將其*放入層流罩中。如果瓶子向內(nèi)塌陷，細(xì)胞將無(wú)法正常生長(zhǎng)。 如果要獲得更多的蛋白產(chǎn)量，有參考文獻(xiàn)表明轉(zhuǎn)染后 24 小時(shí)，可以適當(dāng)稀釋細(xì)胞，稀釋比例參考范圍（1:2—1:5）之間，可以增加蛋白產(chǎn)量，稀釋效應(yīng)與最佳稀釋比率應(yīng)根 據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO  GMP 轉(zhuǎn)染試劑直接加入到細(xì)胞懸液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但必須經(jīng)過(guò)上述 特定流程的 DNA 和轉(zhuǎn)染試劑的比例和用量的相應(yīng)優(yōu)化。

注意事項(xiàng)

1.不同質(zhì)粒種類以及大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，可如較大片段插入質(zhì)?？赡苻D(zhuǎn)染效率低，可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整，如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)粒總量等。

2.細(xì)胞狀態(tài)及代數(shù)會(huì)較大程度影響轉(zhuǎn)染。剛復(fù)蘇細(xì)胞需傳代2-3次以上，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。為保證實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞盡量選擇20代以內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.對(duì)于貼壁性低的細(xì)胞系，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。

初次使用應(yīng)優(yōu)化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉(zhuǎn)染效率。

4.為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。