agilent 210518說(shuō)明書(shū)

agilent 210518即Stratagene 210518

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit

Instruction Manual Catalog # 210518 (10 reactions) and #210519 (30 reactions) Revision F.0

uikchange閃電現(xiàn)場(chǎng)定向誘變?cè)噭┖?/span>

Quikchange閃電現(xiàn)場(chǎng)定向誘變?cè)噭┖?br />提供的材料

Quikchange Lightning Site定向誘變?cè)噭┖校夸?10518）含有足夠的試劑，總共10種。
反應(yīng)，包括2個(gè)控制反應(yīng)。
b Quikchange Lightning Site定向誘變?cè)噭┖校夸?10519）含有足夠30種試劑。
反應(yīng)，包括2個(gè)控制反應(yīng)。
c將dntp混合物解凍一次，制備一次性小份，并將小份儲(chǔ)存在-20°C下。不要對(duì)dntp混合物進(jìn)行處理。
多次凍融循環(huán)。d dntp混合物和dpn i酶的成分是專(zhuān)有的。這些試劑已針對(duì)
quikchange-lightning協(xié)議，并已獲得與其他套件組件一起使用的資格。不
用其他安捷倫試劑盒或其他來(lái)源的dntp混合物或dpn i酶制劑替代。
E基因型：tetr
?（mcra）183?（mcrcb hsdsmr mrr）173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac hte
【F’Proab Laci】
Q
Z?M15 tn10（太特
Amy Camr
]
f見(jiàn)介質(zhì)和試劑的制備。
儲(chǔ)存條件
XL10金超能干細(xì)胞、XL10金β-Me和PUC18控制質(zhì)粒：–80°C
所有其他部件：–20°C
所需附加材料
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管（bd biosciences目錄）
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal）
異丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG）

買(mǎi)方通知
本產(chǎn)品的使用是根據(jù)以下美國(guó)專(zhuān)有技術(shù)號(hào)57891665932419中的一個(gè)或多個(gè)獲得許可的，
6391548、6713285、7132265和7176004。
本產(chǎn)品是根據(jù)Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室和安捷倫技術(shù)公司之間的協(xié)議提供的。
本產(chǎn)品的制造、使用、銷(xiāo)售或進(jìn)口均以我方為準(zhǔn)。拍打。編號(hào)6627424和EP
拍打。Bio-Rad Laboratories，Inc.所有的1 283 875 B1號(hào)。購(gòu)買(mǎi)本產(chǎn)品后將
買(mǎi)方不可轉(zhuǎn)讓使用購(gòu)買(mǎi)的產(chǎn)品和部件的權(quán)利。
研究領(lǐng)域的PCR產(chǎn)品（但不是實(shí)時(shí)PCR），包括所有應(yīng)用研究領(lǐng)域
（包括但不限于動(dòng)物試驗(yàn)和食品試驗(yàn)）。

介紹
Quikchange Lightning站點(diǎn)定向誘變套件*提供突變
質(zhì)粒比我們?cè)瓉?lái)的QuikChange試劑盒快三倍
誘變效率或準(zhǔn)確性的損失。該套件已針對(duì)
高達(dá)14kb質(zhì)粒的誘變，允許快速、和
用單一試劑盒誘變大小質(zhì)粒。使用
先進(jìn)的高保真酶技術(shù)，協(xié)議
加速，同時(shí)保持高的現(xiàn)場(chǎng)指導(dǎo)精度
誘變。QuikChange Lightning網(wǎng)站
誘變?cè)噭┖惺且环N專(zhuān)有技術(shù)的基于pfu的聚合酶混合物。
優(yōu)化的dpn i酶，它們一起允許在
大約一個(gè)小時(shí)，加上一夜之間的轉(zhuǎn)變。

圖1 Quikchange閃電現(xiàn)場(chǎng)定向誘變方法概述。

美國(guó)專(zhuān)有技術(shù)號(hào)7176004；7132265；6734293；6444428；6391548；6183997；
5948663、5932419和5789166。
六
體外定向誘變是一種非常有價(jià)值的技術(shù)
描述蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的動(dòng)態(tài)、復(fù)雜關(guān)系
和功能，用于研究基因表達(dá)元件，以及執(zhí)行
矢量修改。這種技術(shù)的幾種方法
但這些方法通常需要單鏈DNA
（SSDNA）作為模板1–4
勞動(dòng)密集型或技術(shù)難度大。
我們的QuikChange Lightning站點(diǎn)定向誘變套件允許站點(diǎn)特定
幾乎所有雙鏈質(zhì)粒的突變，從而消除
亞克隆和SSDNA救援的需求。5
此外，QuikChange
閃電現(xiàn)場(chǎng)定向誘變?cè)噭┖胁恍枰獙?zhuān)門(mén)的
載體，*的限制位點(diǎn)，多重轉(zhuǎn)化或體外
甲基化處理步驟。簡(jiǎn)單、快速的三步程序需要
僅在轉(zhuǎn)化前1小時(shí)（對(duì)于小于等于5 kb的質(zhì)粒），以及
在單一反應(yīng)中產(chǎn)生效率大于85%的突變體（參見(jiàn)
圖1）。
Quikchange閃電酶是一種新型的專(zhuān)有技術(shù)混合物
包括pfuultra高保真（hf）DNA聚合酶**的衍生物
兩條質(zhì)粒鏈的誘變引物定向復(fù)制
高保真度。所有的基本程序都采用了超螺旋雙絞線。
一個(gè)感興趣的插入物和兩個(gè)合成物的DNA（dsdna）載體
寡核苷酸引物，均含有所需的突變（見(jiàn)圖1）。
寡核苷酸引物，每個(gè)引物與
載體，在溫度循環(huán)過(guò)程中被pfuultra-hf-dna擴(kuò)展。
聚合酶，無(wú)底物置換。寡核苷酸的延伸
引物產(chǎn)生含有交錯(cuò)缺口的突變質(zhì)粒。跟隨
溫度循環(huán)，產(chǎn)品經(jīng)DPN I處理。
內(nèi)切酶（靶序列：5´-GM6ATC-3´）對(duì)甲基化有特異性。
半甲基化DNA，用于消化親本DNA模板
并選擇含有合成DNA的突變。6（DNA分離
幾乎所有的大腸桿菌菌株都是DAM甲基化的，因此對(duì)
含有所需突變的刻痕載體DNA。
然后轉(zhuǎn)化為XL10金超能力細(xì)胞。
注意，質(zhì)粒DNA從幾乎所有常用的
大腸桿菌菌株（DAM+）是甲基化的，是
突變，質(zhì)粒DNA從特殊的DAM中分離出來(lái)-
包括JM110和SCS110在內(nèi)的大腸桿菌菌株不適用。
不需要的第二位點(diǎn)錯(cuò)誤幾乎被消除，高突變
由于該方法的高保真度，
pfuultra-hf-dna聚合酶，使用少量起始dna
模板和使用的熱循環(huán)次數(shù)少。
QuikChange Lightning Site定向誘變?cè)噭┖锌捎糜?br />點(diǎn)突變，替換氨基酸，刪除或插入單個(gè)或
多種相鄰氨基酸。該試劑盒已用質(zhì)粒進(jìn)行了優(yōu)化。
大小從4到14 KB不等。

* NOS的美國(guó)專(zhuān)有技術(shù)。6734293 6444428 6183997和5948663；；；。DNA聚合酶有HF會(huì)pfuultra 18倍比Taq DNA合成的高逼真度
DNA聚合酶。
7
控制quikchange閃電誘變
在pwhitescript 4.5-kb控制質(zhì)粒是用來(lái)測(cè)試的效率
代突變質(zhì)粒使用網(wǎng)站定向quikchange閃電
誘變?cè)噭┖小Ｔ趐whitescript 4.5-kb質(zhì)粒包含停止控制
密碼子TAA密碼子谷氨酰胺在位置（CAA）的其中一個(gè)
通常出現(xiàn)在β-半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒pBluescript II SK（-）
噬菌粒（9相應(yīng)到氨基酸的蛋白質(zhì)）。xl10金
ultracompetent細(xì)胞轉(zhuǎn)化質(zhì)粒與本控制上出現(xiàn)白色
lb–ampicillin瓊脂板（湖的制備和研究——媒體）
含有IPTG和X-gal，因?yàn)?beta;-半乳糖苷酶的活動(dòng)。
obliterated。創(chuàng)建一個(gè)寡核苷酸控制點(diǎn)突變?cè)趐rimers
一個(gè)reverts pwhitescript 4.5-kb控制質(zhì)粒的T殘留的停止
在密碼子的氨基酸（TAA）的β-半乳糖苷酶基因的9個(gè)殘基的C，
生產(chǎn)的谷氨酰胺密碼子（CAA）發(fā)現(xiàn)野生型序列。
以下screened殖民地可以轉(zhuǎn)化為β-半乳糖苷酶
（β-半乳糖+）表型的媒體上的藍(lán)色的顏色含有IPTG和X-gal染色。

底漆設(shè)計(jì)指南
本方案中使用的致突變寡核苷酸引物必須是
根據(jù)所需的突變單獨(dú)設(shè)計(jì)。以下
設(shè)計(jì)誘變引物時(shí)應(yīng)考慮：
♦兩個(gè)誘變引物都必須包含所需的誘變和
在質(zhì)粒的相反鏈上退火到相同的序列。
♦底漆的長(zhǎng)度應(yīng)在25至45個(gè)底座之間，并熔化。
溫度（tm）≥78°C。可使用長(zhǎng)度超過(guò)45個(gè)堿基的底漆，
但使用較長(zhǎng)的引物會(huì)增加二次結(jié)構(gòu)的可能性。
從而影響誘變反應(yīng)的效率。
下列公式通常用于估算
引物：Tm = 81.5 + 0.41(%GC) − (675/N) − % mismatch
計(jì)算tm時(shí)：

•n是底材中的底漆長(zhǎng)度
•%gc和%mismatch的值是整數(shù)
用于計(jì)算用于引入插入或
刪除，使用上述公式的修改版本：
81.5+0.41%（gc）（675/）tm=−n
其中n不包括插入或刪除的基

所需的突變（缺失或插入）應(yīng)在
底漆兩邊各有大約10-15個(gè)正確順序的底座。
♦底漆的低GC含量應(yīng)為40%，并且
應(yīng)以一個(gè)或多個(gè)C或G基終止。
♦引物不需要5´磷酸化。
tm=81.5+0.41%（gc）−（675/n）−不匹配百分比
九
♦對(duì)于典型的誘變引物，脫鹽純化通常是
足夠的。對(duì)于長(zhǎng)的或復(fù)雜的誘變引物，純化
液相色譜法（PLAC/FPLC）或聚丙烯酰胺凝膠
電泳（PAGE）可顯著增加
誘變效率。
其他底漆注意事項(xiàng)
♦誘變方案使用每個(gè)寡核苷酸引物125 ng。
要將納克轉(zhuǎn)化為低聚物的皮摩爾，請(qǐng)使用以下方法
方程式：

保持底漆濃度過(guò)高很重要。我們建議
改變模板量，同時(shí)保持
底漆經(jīng)常過(guò)量。
 協(xié)議
突變鏈合成反應(yīng)（熱循環(huán)）
注意確保質(zhì)粒DNA模板從DAM中分離出來(lái)。+
大腸桿菌菌株。大多數(shù)常用的大腸桿菌菌株
是大壩+。從DAM菌株（如JM110）分離出質(zhì)粒DNA
SCS110）不適用。
為了大限度地提高溫度循環(huán)性能，我們
建議使用薄壁管，確保理想接觸
溫度循環(huán)器的熱阻。以下協(xié)議
使用薄壁管進(jìn)行優(yōu)化。
1。合成兩個(gè)包含所需的
突變，兩側(cè)是未修改的核苷酸序列。凈化這些
在以下步驟中使用前的寡核苷酸引物（參見(jiàn)
誘變引物設(shè)計(jì)）。
2。準(zhǔn)備控制反應(yīng)如下：
5微升10×反應(yīng)緩沖液
pwHitescript 4.5-kb控制質(zhì)粒5μl（25 ng）（5 ng/μl）
1.25微升（125 ng）寡核苷酸對(duì)照引物1
[34摩爾（100 ng/微升）]
1.25微升（125 ng）寡核苷酸對(duì)照引物2
[34摩爾（100 ng/微升）]
1微升dntp混合物
1.5微升液體試劑
34微升DDH2O（使終反應(yīng)體積達(dá)到50微升）
然后添加：
1微升Quikchange閃電酶
三。制備樣品反應(yīng)，如下所示：
注：使用不同數(shù)量的
dsdna模板范圍從10到100 ng（例如，10，25，50，
和100 ng dsdna模板）同時(shí)保持引物
濃度常數(shù)。
5微升10×反應(yīng)緩沖液
dsdna模板的xμl（10–100 ng）
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）1
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）2
1微升dntp混合物
1.5微升液體試劑
DDH2O，終體積為50μl

然后添加：
1微升Quikchange閃電酶
十一
4。使用表1中列出的循環(huán)參數(shù)循環(huán)每個(gè)反應(yīng)。
（對(duì)于控制反應(yīng)，延長(zhǎng)2.5分鐘。）
表一
定向QuikChange閃電場(chǎng)地的循環(huán)參數(shù)
誘變方法

例如，5-kb質(zhì)粒在68°C條件下每個(gè)周期需要2.5分鐘。

DPN I放大產(chǎn)物的消化
1。直接將2微升提供的DPN I限制酶添加到每個(gè)
放大反應(yīng)。
注：僅使用所提供的DPN I酶；不得用
另一種來(lái)源的酶。
2。輕輕和*地混合每個(gè)反應(yīng)混合物
上下解決方案多次。簡(jiǎn)單地降低反應(yīng)速度
混合物，然后立即在37°C下培養(yǎng)5分鐘以消化。
親本（即非突變的）超壓縮dsdna。
XL10金超能力細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
注意：在繼續(xù)之前，請(qǐng)閱讀轉(zhuǎn)換指南。
轉(zhuǎn)換協(xié)議。
XL10金細(xì)胞對(duì)四環(huán)素和
氯霉素。如果突變質(zhì)粒只含有tetr
或抗camr標(biāo)記，一種有能力細(xì)胞的替代品系。
必須使用。
1。在冰上輕輕融化XL10金超能力細(xì)胞。對(duì)于每一個(gè)
待轉(zhuǎn)化的對(duì)照反應(yīng)和樣品反應(yīng)，等分45微升
14 ml bd falcon聚丙烯的超能力細(xì)胞
圓底管。
2。將隨試劑盒提供的2μlβ-Me混合物添加到45μl的
細(xì)胞。（使用β-Me的替代來(lái)源可能會(huì)減少轉(zhuǎn)化
效率。
三。輕輕地旋轉(zhuǎn)管中的內(nèi)容物。在冰上培養(yǎng)細(xì)胞
2分鐘。

4。從每個(gè)對(duì)照品和樣品中轉(zhuǎn)移2微升經(jīng)dpn i處理的DNA。
對(duì)分離部分超能力細(xì)胞的反應(yīng)。
作為可選控制，驗(yàn)證
通過(guò)添加1微升0.01 ng/微升puc18的XL10金超能力細(xì)胞
對(duì)照質(zhì)粒（在水中稀釋1:10的對(duì)照品）
另一個(gè)45-微升的小份細(xì)胞。
5。輕輕旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，混合和培養(yǎng)
冰上反應(yīng)30分鐘。
注：此步驟的培養(yǎng)時(shí)間可縮短至
10分鐘，轉(zhuǎn)換過(guò)程中無(wú)重大損失
效率。
6。在A中預(yù)熱NZY+肉湯（見(jiàn)介質(zhì)和試劑的制備）
步驟9中使用的42°C水浴。
注：XL10金超能力細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
使用NZY+肉湯優(yōu)化。
7。在42°C水浴中加熱脈沖管30秒。持續(xù)時(shí)間
熱脈沖對(duì)獲得率至關(guān)重要。做
不超過(guò)42°C。
注：該熱脈沖已優(yōu)化用于
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管。
8。在冰上孵育試管2分鐘。
9。向每個(gè)試管中加入0.5毫升預(yù)熱（42°C）NZY+肉湯，然后孵化。
管道在37°C下振動(dòng)1小時(shí)，轉(zhuǎn)速為225–250轉(zhuǎn)/分。
十三
10。將每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的適當(dāng)體積，如
下表所示，在含有適當(dāng)
質(zhì)粒載體的抗生素。
對(duì)于誘變和轉(zhuǎn)化控制，將細(xì)胞傳到
LB-氨芐西林瓊脂平板，含80μg/ml x-gal和20 mm IPTG
（參見(jiàn)準(zhǔn)備用于彩色篩選的瓊脂板）。
轉(zhuǎn)化反應(yīng)電鍍量

當(dāng)電鍍體積小于100μl時(shí)，在
瓊脂平板，用移液管將小體積的轉(zhuǎn)化反應(yīng)移入池中，然后
攤鋪混合物。
B撒布量根據(jù)
誘變質(zhì)粒。通常對(duì)整個(gè)變換混合物進(jìn)行電鍍是有用的，
分為多個(gè)板，覆蓋一系列電鍍體積。
11。將轉(zhuǎn)化板在37°C下培養(yǎng)16小時(shí)以上。
控件轉(zhuǎn)換的預(yù)期結(jié)果
pwhitescript轉(zhuǎn)換后的預(yù)期菌落數(shù)
4.5kb對(duì)照誘變反應(yīng)>100個(gè)菌落。大于85%
菌落應(yīng)含有突變，并在瓊脂上呈藍(lán)色菌落。
含有IPTG和X-Gal的板。
注意pwitescript 4.5-kb的誘變效率（Me）
對(duì)照質(zhì)粒的計(jì)算公式如下：

如果對(duì)puc18控制質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，
>應(yīng)觀察到50個(gè)菌落（>109 cfu/μg），其中>98%的菌落具有
藍(lán)色表型。
樣本轉(zhuǎn)換的預(yù)期結(jié)果
預(yù)期菌落數(shù)取決于基組分和長(zhǎng)度。
使用的DNA模板。關(guān)于增加殖民地的建議
編號(hào)，請(qǐng)參閱故障排除。插入感興趣的內(nèi)容應(yīng)排序?yàn)?br />驗(yàn)證所選克隆是否包含所需的突變。

轉(zhuǎn)型指導(dǎo)方針
儲(chǔ)存條件
超能力細(xì)胞對(duì)溫度的微小變化很敏感。
必須存放在-80°C冰箱的底部。從傳輸管道
一個(gè)冷凍室到另一個(gè)冷凍室可能會(huì)導(dǎo)致效率下降。超級(jí)電容器
電池應(yīng)直接從干冰運(yùn)輸容器放置在-80°C。
對(duì)齊單元格
配藥時(shí)，應(yīng)始終將超能力細(xì)胞放在冰上。這是必要的。
把bd falcon聚丙烯管放在電池前的冰上
解凍后，細(xì)胞被直接分配到預(yù)成丘的試管中。
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管的使用
重要的是14毫升bd falcon聚丙烯圓底管
（BD Biosciences Catalog_）用于轉(zhuǎn)換協(xié)議，
因?yàn)槠渌嚬芸赡軙?huì)被β-巰基乙醇降解
轉(zhuǎn)換協(xié)議。此外，熱脈沖步驟的持續(xù)時(shí)間為
關(guān)鍵，并針對(duì)厚度和形狀進(jìn)行了專(zhuān)門(mén)優(yōu)化
這些管子。
β-巰基乙醇的使用
β-巰基乙醇（β-Me）可以增加轉(zhuǎn)化率。
效率。該試劑盒中提供的XL10金β-巰基乙醇混合物是
稀釋后即可使用。
添加的DNA數(shù)量
當(dāng)添加2μl合成物時(shí)，觀察到大效率。
反應(yīng)。當(dāng)添加一個(gè)
盡管總效率可能
低一些。
熱脈沖的長(zhǎng)度和溫度
有一個(gè)由熱量產(chǎn)生的效率高的限定窗口。
轉(zhuǎn)換過(guò)程中的脈沖。在細(xì)胞中觀察到效率。
熱脈沖30秒。不得超過(guò)42°C。
彩色篩選用瓊脂板的制備
準(zhǔn)備用于藍(lán)白篩選的LB瓊脂平板，添加80μg/ml。
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal），20 mm
異丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG），以及適當(dāng)?shù)?br />LB瓊脂的抗生素?；蛘?，100μl的10 mm IPTG和100μl
2%的x-gal可以在電鍍前30分鐘在LB瓊脂板上涂抹。
轉(zhuǎn)變。用無(wú)菌的DH2O制備IPTG；用
二甲基甲酰胺（DMF）。之前不要混合IPTG和X-GAL
用移液管把它們移到盤(pán)子上，因?yàn)檫@些化學(xué)物質(zhì)會(huì)沉淀。

故障排除
當(dāng)根據(jù)本說(shuō)明手冊(cè)中概述的指南使用時(shí)，此套件提供可靠的
使用dsdna模板進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法?；A(chǔ)成分的變化
DNA模板的長(zhǎng)度和熱循環(huán)性能可能導(dǎo)致
誘變效率。