BIOCHECK Inc.是新抗體發(fā)現(xiàn)和免疫測(cè)定開(kāi)發(fā)服務(wù)的綜合提供商。

PD-1 ENZYME IMMUNOASSAY TEST KIT   Catalog Number: BC-1301

pd-1酶免疫測(cè)定試劑盒   目錄編號(hào)：bc-1301

酶免疫法定量測(cè)定人血清和血漿中Pd-1濃度

只作研究用途

不適用于診斷程序

介紹

程序性細(xì)胞死亡蛋白1(pd-1，CD 279，pdd 1)是一種細(xì)胞表面受體，是調(diào)節(jié)T細(xì)胞炎癥活動(dòng)和維持免疫外周耐受的關(guān)鍵。 系統(tǒng)(1)。pd-1可以與配體pd-l1和pd-l2t相互作用。pd-1具有胞外IGV結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)尾部?jī)蓚€(gè)磷酸化位點(diǎn)(shp-1和shp-2)。 o下調(diào)免疫系統(tǒng)，抑制T細(xì)胞活性(2)?？乖R(shí)別后，活化的T細(xì)胞在其表面表達(dá)pd-1，產(chǎn)生干擾素，誘導(dǎo)pd的表達(dá)。 -L1，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞死亡。(3)當(dāng)被腫瘤細(xì)胞劫持時(shí)，pd-1配體的異常表達(dá)抑制免疫調(diào)節(jié)的T細(xì)胞活化，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。 （表示方向）向 (4).

血清和血漿中Pd-1水平升高與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和皮膚硬化有關(guān)(5，6)。Pd-1主要由腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞(7)表達(dá).進(jìn)一步區(qū)域 研究表明，使用針對(duì)pd-1免疫檢查點(diǎn)的單克隆抗體有助于在理解和治療黑色素瘤和其他vario等癌癥方面取得突破性進(jìn)展。 美國(guó)非小細(xì)胞肺癌(4)。

測(cè)定原理

pd-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是以固相酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為基礎(chǔ)的.該檢測(cè)系統(tǒng)使用了針對(duì)不同抗原決定的*的單克隆抗體對(duì)。 pd-1分子上的NT。用一種小鼠抗PD-1單克隆抗體進(jìn)行固相固定(在微滴度井上).另一種與辣根堿結(jié)合的單克隆抗pd-1抗體 過(guò)氧化物酶(HRP)存在于酶的共軛溶液中。測(cè)試樣本被允許與這兩種抗體依次反應(yīng)，導(dǎo)致pd-1分子被夾在固體ph之間。 ASE和酶解抗體。在室溫下進(jìn)行兩次單獨(dú)的60分鐘孵育后，用洗滌緩沖液沖洗水井，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體。添加了TMB試劑 D在黑暗條件下孵育20分鐘，形成藍(lán)色。隨著停止解決方案的添加，顏色開(kāi)發(fā)停止，將顏色更改為黃色。c Pd-1的濃度與樣品的顏色強(qiáng)度成正比.在450 nm處分光度法測(cè)定吸光度。

提供的試劑和材料

抗體包被井(1板，96井)微滴度井，用小鼠單克隆抗pd-1包被。

含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-BSA溶液中50 ng/ml Pd-1標(biāo)準(zhǔn)品(0.5 mL/小瓶)

標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑和樣品稀釋劑(30 mL/瓶，1瓶)含有含防腐劑的磷酸鹽緩沖液-bsa溶液。

酶結(jié)合試劑(12 mL/小瓶，1小瓶)含有與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的小鼠單克隆抗pd-1。

20倍洗滌劑磷酸鹽緩沖液(50 mL/瓶，1瓶)

TMB試劑(11 mL/瓶，1瓶)含有一步TMB溶液。

停液(11 mL/瓶，1瓶)含有稀釋鹽酸(1NHCl)

貯藏條件

將未打開(kāi)的工具包保存在2-8°C，收到后，當(dāng)它沒(méi)有使用，直到到期顯示在工具包標(biāo)簽上。有關(guān)過(guò)期日期，請(qǐng)參閱包標(biāo)簽。

將微滴度板放在一個(gè)裝有干燥劑的密封袋中，以盡量減少對(duì)潮濕空氣的暴露。

 試劑準(zhǔn)備

1.所有試劑在使用前應(yīng)允許達(dá)到室溫(18-25°C)。

2.對(duì)于每次測(cè)試運(yùn)行，準(zhǔn)備一個(gè)新的標(biāo)準(zhǔn)集。

3.用標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑稀釋50~10 ng/mL。用標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑制備10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)的雙倍系列稀釋劑：

a.10納克/毫升：0.12毫升50納克/毫升0.48毫升標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑

b.5納克/毫升：0.25毫升10納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑

c.2.5納克/毫升：0.25毫升5納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑

1.25ng/mL：0.25毫升2.5納克/毫升標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑

e.0.625 ng/mL：1.25ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑0.25mL

f.0.313 ng/mL：0.25mL/0.625 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋劑2

標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑0.156 ng/mL：0.313 ng/mL 0.25mL

i.0 ng/mL：0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑

5.病人樣本在使用前需要稀釋4倍。制備一系列小管(即1.5 mL微離心管)，將60L血清與180 L標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋劑混合。

6.工作洗滌緩沖器：從20倍庫(kù)存中制備1倍洗滌緩沖液。加入50毫升的20倍洗滌緩沖液庫(kù)存到950毫升的直接水。工作洗滌緩沖液在2~8°C溫度下穩(wěn)定運(yùn)行30天.注：任何晶體 這可能是由于高鹽濃度的存在，必須在室溫下再溶解，然后再進(jìn)行稀釋。

檢測(cè)程序

準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)。見(jiàn)試劑準(zhǔn)備。

稀釋樣品1：4稀釋。見(jiàn)試劑準(zhǔn)備。

確保所需數(shù)量的涂層井在保持架。

配發(fā)Pd-1標(biāo)準(zhǔn)的100mL，并將樣品稀釋到適當(dāng)?shù)木?

室溫(18-25°C)孵育60 min.

將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300mL工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水紙或紙上 r毛巾去除所有殘留水滴。

將Pd-1工作酶結(jié)合劑的100mL配伍到每口井中.

室溫(18-25°C)孵育60 min.

將培養(yǎng)皿中的內(nèi)容物倒入廢容器中，將孵化器中的混合物移除。用300 ul工作水洗緩沖液沖洗微滴水井5次。把水井打到吸水紙或紙上 r毛巾去除所有殘留水滴。

在每口井中分配100mL TMB溶液。

室溫(18-25°C)孵育20分鐘.

通過(guò)在每口井中加入100mL的停止溶液來(lái)停止反應(yīng)。

輕輕攪拌30秒。重要的是要確保所有的藍(lán)色*變成黃色。

14.在450 nm處讀取吸光度，15分鐘內(nèi)使用微滴度良好的閱讀器。

統(tǒng)計(jì)

計(jì)算每組參考標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和樣品的平均吸光度值(OD 450)。

通過(guò)繪制每個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度(以納克/毫升為單位)繪制在圖表紙上，并在垂直(Y)軸和濃度上繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。 在水平(X)軸上。

用每個(gè)樣品的平均吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測(cè)定相應(yīng)的Pd-1濃度(ng/mL)。視經(jīng)驗(yàn)和/或計(jì)算機(jī)可用情況而定 可以使用其他的數(shù)據(jù)縮減方法。

樣品的檢出值應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)為4，得到Pd-1的結(jié)果為ng/ml。

標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)例

一個(gè)典型的標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)行結(jié)果，吸光度讀數(shù)在450 nm處顯示在Y軸上，而pd-1濃度顯示在X軸上。注：這條標(biāo)準(zhǔn)曲線是為了說(shuō)明 僅用于計(jì)算未知數(shù)，不應(yīng)用于計(jì)算未知數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室必須在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中生成自己的數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

工作特性

敏感，感受性

用2SD法測(cè)定的Pd-1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的低檢出濃度為0.15ng/ml。

度，準(zhǔn)確（性）

1. 在一次測(cè)定中，通過(guò)對(duì)三種不同樣品的重復(fù)測(cè)定，確定了內(nèi)測(cè)精密度.批內(nèi)可變性如下所示：

b.在一系列單獨(dú)校準(zhǔn)的測(cè)試中，通過(guò)對(duì)三個(gè)不同樣本的重復(fù)測(cè)量，確定了運(yùn)行間精密度。批間變異顯示b。 below在下面，到下面

1.回收率和線性研究?；厥諛悠芳尤胍阎腜d-1水平，并一式兩份進(jìn)行測(cè)定。平均回收率為105.3%。

b. 對(duì)三個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，以確定線性度。平均回收率為99.6%。

參考

費(fèi)夫，B.T.，&Pauken，K.E.(2011年)。PD-1通路在自身免疫和外周耐受中的作用。“紐約科學(xué)院年鑒”，1217(1)，45-59。

Riella，L.V.，Paterson，A.M.，Sharpe，A.H.，&Chandraker，A.(2012)。PD-1通路在免疫應(yīng)答中的作用。美國(guó)移植雜志：美國(guó)社會(huì)雜志 移植和美國(guó)移植外科醫(yī)生協(xié)會(huì)，12(10)，2575-2587。

Zak，Krzysztof&Kitel，Rados?aw&Przetocka，Sara&Golik，Przemys?aw&Guzik，Katarzyna&Musielak，Bogdan&D mling，Alexander&Dubin，Grzegorz&Holak，Tad。(2015年)。胡氏情結(jié)結(jié)構(gòu) 人類編程死亡1，pd-1，及其配體PD-L1。結(jié)構(gòu)。23.。10.1016/j.str.2015.09.010。

Zoran Gatalica，卡麗·斯奈德，托德·馬尼，阿納托爾·加扎爾普爾，丹尼爾·霍特曼，年青肖，佩吉·奧夫伯格，因加羅斯，加吉·巴蘇，塞米爾·弗拉尼茨，亨利·林奇，丹尼爾·馮霍夫和奧米德·哈米 d.程序化細(xì)胞死亡1(PD-1)及其配體(PD-L1)在常見(jiàn)癌癥中的作用及其與分子腫瘤類型的關(guān)系。癌癥流行病學(xué)研究2014年12月1日(23)(12)2965-2970。

Greisen，S.，Rasmussen，T.，Stengaard-Pedersen，K.，Hetland，M.，H rselv-Petersen，K.，Hvid，M.，&Deleuran，B.(2013年)?？扇苄猿绦蛐运劳?(spd-1)的增加與疾病活動(dòng)有關(guān)。 早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影像學(xué)進(jìn)展。斯堪的納維亞風(fēng)濕病學(xué)雜志，43(2)，101-108。

Yanaba，K.，Hayashi，M.，Yoshihara，Y.，&Nakagawa，H.(2016)。系統(tǒng)性硬化癥患者血清可溶性程序性死亡-1和程序性死亡配體-1水平與皮膚硬化程度的關(guān)系 。皮膚科雜志，43(8)，954-957。

7.Ahmadzadeh，M.，Johnson，L.A.，Heemskerk，B.，Wunderlich，J.R.，Dudley，M.E.，White，D.E.，&Rosenberg，S.A.(2009年)。腫瘤抗原特異性CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤高表達(dá)水平 Pd-1的LS和功能受損。血液，114(8)，1537-1544。